Presence of mast cells in the rat pericranium ­ a tissue very sensitive to pain / Presença de mastócitos no pericrânio do rato ­ tecido muito sensível à dor

Objective: To evaluate mast cell presence in the pericranium of Wistar rats. Methods: Five male rats of the Wistar strain were used. The animals were housed under a 12 h light cycle with ad libitum access to food and water and allowed 10 days of acclimatization before tissue sampling. The five rats were anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine/xylazine, 10/20 mg/kg. Following aseptic preparation of the head skin, a midline longitudinal incision was made to expose the pericranium. Two samples of the pericranium were taken, one from the right and one from the left. These samples were fixed in 10% buffered formaldehyde for 24 h. After fixation, tissue samples were paraffin-embedded and sectioned at 4 µm. Then, slides were deparaffinized, stained with a concentration of 0.1% toluidine blue for 1 min, and washed with distilled water. Last, slides were photomicrographed under 400x magnification to identify mast cells. Results: Mast cells were identified in the dura mater and the five rats' pericranium. In the dura mater, mast cells were also found in these rats. We found both granulated (intact) and degranulated mast cells. Conclusion: We suggest that future preclinical studies investigating the involvement of dural mast cells and other meningeal cell populations should also include pericranium samples to explore this structure's relevance in migraine pain and other headache disorders.

Objetivo: Avaliar a presença de mastócitos no pericrânio de ratos Wistar. Métodos: Foram utilizados cinco ratos machos da linhagem Wistar. Os animais foram alojados sob um ciclo de luz de 12 horas com acesso ad libitum a comida e água e tiveram 10 dias de aclimatação antes da amostragem de tecido. Os cinco ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina, 10/20 mg/kg. Após preparação asséptica da pele da cabeça, foi feita uma incisão longitudinal na linha média para expor o pericrânio. Foram retiradas duas amostras do pericrânio, uma da direita e outra da esquerda. Essas amostras foram fixadas em formaldeído tamponado a 10% por 24 horas. Após a fixação, as amostras de tecido foram embebidas em parafina e seccionadas a 4 µm. Em seguida, as lâminas foram desparafinizadas, coradas com concentração de azul de toluidina 0,1% por 1 min e lavadas com água destilada. Por fim, as lâminas foram fotomicrografadas com aumento de 400x para identificação de mastócitos. Resultados: Foram identificados mastócitos na dura-máter e no pericrânio dos cinco ratos. Na dura-máter, mastócitos também foram encontrados nesses ratos. Encontramos mastócitos granulados (intactos) e desgranulados. Conclusão: Sugerimos que futuros estudos pré-clínicos que investiguem o envolvimento de mastócitos durais e outras populações de células meníngeas também incluam amostras de pericrânio para explorar a relevância desta estrutura na dor da enxaqueca e em outros distúrbios de cefaleia.

Storage and purification adaptations for the isolation of total RNA from the dura mater / Adaptações no armazenamento e purificação para o isolamento de RNA total da dura-máter

Abstract Background RNA extraction is a step that precedes several molecular techniques. The fibrous tissue, more specifically the dura mater, has several limitations in routine protocols, and lacks optimization protocols to overcome these problems. Objective To test stock reagents and purification kits, optimizing commercial kit protocols for RNA extraction from the dura mater. Methods Dura mater samples were obtained from eight Wistar rats and maintained in two different stabilizers. The samples were purified using four different protocols, and the RNA was evaluated for the yield and purity in NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States). Beta-actin gene was used for analyzing gene expression, since is one of the most used reference genes. Results The RNA preservation was similar in both stabilizers. The addition of an incubation step prior the purification protocols allowed better tissue digestion and RNA recovery. The RNA purified using the protocols membrane-based showed higher quality than liquid-liquid purification. This impact was observed in the 3-week evaluation using RT-qPCR. Conclusion Stabilizers are efficient for RNA preservation and membrane-based purification protocols are more suitable for RNA recovery from dura mater tissue, allowing the evaluation of gene expression in this type of tissue. Adaptations in the dura mater RNA extraction protocol differ from the pre-established protocols because it takes into account the peculiarity of fibrous tissue and low cellularity. In addition to providing a low-cost mechanism, based on techniques that are part of the laboratory routine, it is possible to improve the quality of the extracted material, ensuring greater efficiency in the use of subsequent techniques.

Resumo Antecedentes A extração de RNA é uma etapa que antecede várias técnicas moleculares. O tecido fibroso, mais especificamente a dura-máter, apresenta várias limitações nos protocolos de rotina e carece de protocolos de otimização para superar estes problemas. Objetivo Testar reagentes de estoque e kits de purificação, otimizando protocolos de kits comerciais para extração de RNA da dura-máter. Métodos Amostras de dura-máter foram obtidas de oito ratos Wistar e mantidas em dois estabilizadores diferentes. As amostras foram purificadas em quatro protocolos diferentes e o RNA foi avaliado quanto ao rendimento e pureza no NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States). O gene da beta-actina foi utilizado para analisar a expressão gênica, uma vez que é um dos genes de referência mais utilizados. Resultados A preservação do RNA foi semelhante em ambos os estabilizadores. A adição de uma etapa de incubação antes dos protocolos de purificação permitiu uma melhor digestão do tecido e recuperação de RNA. O RNA purificado pelos protocolos baseados em membrana apresentou qualidade superior ao da purificação líquido-líquido. Este impacto foi observado na avaliação de três semanas usando RT-qPCR. Conclusão Os estabilizadores são eficientes para preservação do RNA e os protocolos de purificação baseados em membrana são mais adequados para recuperação de RNA do tecido da dura-máter, permitindo a avaliação da expressão gênica neste tipo de tecido. As adaptações no protocolo de extração de RNA da dura-máter diferem dos protocolos preestabelecidos porque leva em consideração a peculiaridade do tecido fibroso e com baixa celularidade. Além de fornecer um mecanismo de baixo custo, baseado em técnicas que fazem parte da rotina laboratorial, é possível melhorar a qualidade do material extraído, garantindo maior eficácia no uso de técnicas subsequentes.